การพัฒนาและการตรวจสอบความถูกต้องของ ELISA ที่ปิดกั้น epitope โดยใช้แอนติบอดี anti-haemagglutinin monoclonal สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีอย่างจำเพาะในซีรั่มแกะและแพะที่มุ่งต่อต้านไวรัสเพสเต้ เด เพตทิสสัตว์เคี้ยวเอื้อง โดย Bodjo SC, Baziki JD, Nwankpa N, Chit (2023)

สัตว์เคี้ยวเอื้อง Peste des petits (PPR) เป็นโรคติดต่อและมีความสำคัญทางเศรษฐกิจที่ส่งผลต่อการผลิตสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็ก (เช่น แกะและแพะ) เมื่อคำนึงถึงบทเรียนที่ได้รับจาก Global Rinderpest Eradication Program (GREP) ปัจจุบัน PPR ตกเป็นเป้าหมายของประชาคมสัตวแพทย์นานาชาติในฐานะโรคสัตว์ชนิดต่อไปที่จะต้องกำจัดให้สิ้นซาก เพื่อสนับสนุนโครงการทวีปแอฟริกาสำหรับการควบคุม PPR ศูนย์วัคซีนสัตวแพทย์ Pan African แห่งสหภาพแอฟริกา (AU-PANVAC) กำลังพัฒนาเครื่องมือวินิจฉัย ในที่นี้ เราจะอธิบายถึงการพัฒนาวิธีสกัดกั้นเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนต์แอสเซย์ (bELISA) ที่ช่วยให้สามารถทดสอบตัวอย่างจำนวนมากเพื่อตรวจหาแอนติบอดีที่จำเพาะต่อไวรัส PPR ในซีรั่มแกะและแพะ PPR beELISA ใช้ anti-haemagglutinin (H) monoclonal antibody (MAb) เป็นแอนติบอดีของคู่แข่ง และผลการทดสอบจะถูกตีความโดยใช้เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้ง (PI) ของการจับ MAb ที่สร้างขึ้นโดยตัวอย่างซีรั่ม ค่า PI ที่ต่ำกว่าหรือเท่ากับ 18% (PI ≤ 18%) เป็นค่าลบ ค่า PI ที่มากกว่าหรือเท่ากับ 25% (PI ≥ 25%) เป็นค่าบวก และค่า PI ที่มากกว่า 18% และต่ำกว่า 25% เป็นที่น่าสงสัย ความจำเพาะในการวินิจฉัย (DSp) และความไวในการวินิจฉัย (DSe) พบว่าอยู่ที่ 100% และ 93.74% ตามลำดับ PPR-bELISA ที่ใช้ H มีความสัมพันธ์ที่ดีกับการทดสอบการทำให้เป็นกลางของไวรัส (VNT) ซึ่งเป็นการทดสอบมาตรฐานทองคำ โดยมีค่าแคปปาเท่ากับ 0.947 PPR-bELISA แบบ H นั้นมีความเฉพาะเจาะจงมากกว่าชุดเชิงพาณิชย์ ID Screen® PPR Competition (PPR-cELISA แบบ N) จาก IDvet (ฝรั่งเศส) แต่ชุดเชิงพาณิชย์นั้นไวกว่า PPR-bELISA แบบ H เล็กน้อย กระบวนการตรวจสอบยังบ่งชี้ถึงความสามารถในการทำซ้ำและความสามารถในการทำซ้ำที่ดีของ PPR-bELISA แบบ H ทำให้การทดสอบใหม่นี้เป็นเครื่องมือที่เหมาะสมสำหรับการเฝ้าระวังและติดตามผลซีโรโมชันของแคมเปญการฉีดวัคซีน

สัตว์เคี้ยวเอื้อง Peste des petits (PPR) เป็นโรคไวรัสที่ติดต่อได้สูงในสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กที่มีผลกระทบทางเศรษฐกิจสูง อัตราการตายและการเจ็บป่วยสามารถอยู่ในช่วงตั้งแต่ 50 ถึง 90% และ 10 ถึง 90% ตามลำดับ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกลุ่มประชากรที่ไร้เดียงสา [[1] , [2] ]. สาเหตุของโรคคือไวรัส PPR (PPRV) ซึ่งอยู่ในสกุล Morbillivirus ภายในครอบครัว Paramyxoviridae [[3] ]. ไวรัสสกุล Morbilli รวมถึงไวรัส rinderpest (RPV) ไวรัสโรคหัด (MV) ไวรัสโรคพิษสุนัขบ้า (CDV) ไวรัสโรคไข้หัดสุนัข (PDV) และปลาโลมา ปลาโลมา สัตว์จำพวกวาฬ และไวรัส morbilliviruses ในแมว [[2] - [6] ]. PPR ถูกอธิบายเป็นครั้งแรกในปี 1942 ในโกตดิวัวร์ [[7] ] และมีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในแอฟริกาตะวันตกเป็นหลัก พื้นที่ทางภูมิศาสตร์เฉพาะถิ่นของ PPR ได้ขยายตัวอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วง 15 ปีที่ผ่านมา ขณะนี้มีรายงาน PPR ในพื้นที่ส่วนใหญ่ของประเทศทางตอนใต้ของทะเลทรายซาฮาราและแอฟริกาเหนือ [[2] , [9] ], ตะวันออกกลาง [[2] , [9] - [12] ], ไก่งวง [[2] , [8] , [13] , [14] ] และส่วนใหญ่ของเอเชีย [[2] , [9] , [15] - [17] ]. การขยายตัวนี้อาจเนื่องมาจากการเพิ่มขึ้นของการเคลื่อนย้ายสัตว์ระหว่างประเทศและการปรับปรุงเทคนิคในห้องปฏิบัติการที่ช่วยให้สามารถวินิจฉัยโรค PPR ได้อย่างเฉพาะเจาะจงและความแตกต่างของโรคนี้จากโรคอื่นๆ ที่มีผลต่อสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กที่มีอาการคล้ายคลึงกัน เช่น โรคไรเดอร์เพสท์ โรคปอดบวม โรคปอดบวมชนิดพาสเจอร์เรลโลซิส และโรคปอดอักเสบจากเยื่อหุ้มปอดอักเสบชนิดแคปริน . ขณะนี้มีการทดสอบในห้องปฏิบัติการสามประเภทและมีการใช้เป็นประจำเพื่อยืนยันการระบาดของ PPR การทดสอบเหล่านี้ประกอบด้วยการตรวจหาแอนติเจน PPRV และกรดนิวคลีอิก [[18] - [21] ], การแยกไวรัสและการสร้างจีโนไทป์ของไวรัส [[9] , [11] , [18] , [22] , [23] ] และการตรวจหาแอนติบอดีต่อ PPRV [[24] - [26] ].

โดยคำนึงถึงบทเรียนที่ได้รับจาก Global Rinderpest Eradication Program (GREP) และการมีอยู่ของวัคซีน PPR-homologous ที่ให้การป้องกันที่ดีแก่แกะและแพะจาก PPR [[27] , [28] ] ชุมชนสัตวแพทย์ระหว่างประเทศได้ตัดสินใจที่จะมุ่งเน้นความพยายามในการควบคุมและกำจัด PPR ทั่วโลก ในแอฟริกา สำนักงานทรัพยากรสัตว์ระหว่างแอฟริกาแห่งสหภาพแอฟริกา (AU-IBAR) และศูนย์วัคซีนสัตวแพทย์แพน-แอฟริกาแห่งสหภาพแอฟริกา (AU-PANVAC) ได้พัฒนา “โครงการแพนแอฟริกันเพื่อการควบคุมและกำจัดเชื้อ PPR (PPCE-) ปชป.)”. โปรแกรมนี้ถูกนำมาใช้โดยรัฐมนตรีที่รับผิดชอบด้านทรัพยากรสัตว์ในแอฟริกาในช่วง 9 ของพวกเขาไทยการประชุมรัฐมนตรีที่เมืองอาบีจาน ประเทศโกตดิวัวร์ ในเดือนเมษายน พ.ศ. 2556 ระหว่างปี 82ndการประชุมสมัชชา OIE ในเดือนพฤษภาคม 2014 ผู้แทนได้รับการรับรองโดยมติที่มุ่งเน้นความพยายามทั่วโลกในการควบคุมและกำจัด PPR [[29] ]. หนึ่งปีต่อมา องค์การอาหารและเกษตรแห่งสหประชาชาติ (FAO) และองค์การอนามัยสัตว์โลก (OIE) ได้จัดประชุมนานาชาติเพื่อควบคุมและกำจัดเชื้อ PPR ที่เมืองอาบีจาน ประเทศโกตดิวัวร์ ในระหว่างการประชุมนั้น ผู้เข้าร่วมได้ให้การรับรอง PPR Global Control and Eradication Strategy (PPR-GCES) [[30] ] และรับทราบบทบาทของการวิจัยเพื่อปรับปรุงวัคซีน PPR และเครื่องมือวินิจฉัยปัจจุบันเพื่อสนับสนุนการดำเนินการตามกลยุทธ์ สำหรับการเฝ้าระวังโรคในสัตว์และการติดตามประสิทธิภาพของโปรแกรมวัคซีน การตรวจด้วยวิธีเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนต์ (ELISA) ได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือในอุดมคติ [[31] - [33] ]. ปัจจุบัน ELISAs (cELISA) ที่แข่งขันได้สองรายการได้รับการพัฒนาและใช้เพื่อตรวจหาแอนติบอดีที่ต่อต้าน PPRV: PPR-cELISA ที่ใช้ H [[24] ] และ PPR-cELISA ที่ใช้ N [[25] ] โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี (MAbs) ที่ต่อต้านโปรตีน PPRV เฮแมกกลูตินิน (H) และโปรตีนนิวคลีโอโปรตีน (N) ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม สถาบัน Pirbright (สหราชอาณาจักร) ได้หยุดการผลิตชุด PPR-cELISA แบบ H เมื่อเร็ว ๆ นี้ และชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์เพียงชุดเดียวที่มีจำหน่ายในปัจจุบันคือ ID Screen® PPR Competition (PPR-cELISA ที่ใช้ N) ซึ่งผลิตและจัดหาโดย IDvet อยู่ที่เมืองมงเปลลีเยร์ ประเทศฝรั่งเศส ห้องปฏิบัติการสัตวแพทย์ในแอฟริกาส่วนใหญ่ที่มีความท้าทายทางการเงินอยู่แล้วกำลังประสบปัญหาในการซื้อชุดทดสอบเชิงพาณิชย์นี้ เพื่อแก้ไขปัญหานี้และเพื่อให้มีชุดตรวจวินิจฉัย PPR ที่หลากหลาย AU-PANVAC ได้พัฒนา ELISA (bELISA) ที่ราคาย่อมเยา มีความไวสูง และเฉพาะเจาะจง การทดสอบนี้ขึ้นอยู่กับการใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีกับโปรตีน PPRV H ในฐานะแอนติบอดีของคู่แข่ง การทดสอบใหม่นี้จะใช้เป็นเครื่องมือในการวินิจฉัยเพื่อสนับสนุนห้องปฏิบัติการในแอฟริกาสำหรับการควบคุมและกำจัด PPR บทความนี้อธิบายการพัฒนาและกระบวนการตรวจสอบของ PPR beELISA

การทดสอบการทำให้เป็นกลางของไวรัส (VNT) โดยใช้ระบบการทำให้เป็นกลางในระดับจุลภาคเพื่อตรวจหาแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อ PPRV [[34] ] ถูกดำเนินการเพื่อกำหนดสถานะของซีรั่ม วัสดุต่อไปนี้ถูกนำมาใช้เพื่อดำเนินการ VNT; สารแขวนลอยในเซลล์ไตลิงเขียวแอฟริกัน (Vero) ที่ 600,000 เซลล์/มล. ตัวอย่างซีรั่มที่ไม่ใช้งานความร้อน (56°C เป็นเวลา 30 นาที) อาหารเลี้ยงเซลล์ที่เสริมด้วยซีรั่มลูกวัวในครรภ์ 10% (FCS) การเจือจาง PPRV (1,000, 100, 10 และ 1 TCID_SB_50_sb_/ml) และเพลตเพาะเลี้ยงเซลล์ 96 หลุม เตรียมตัวอย่างซีรั่มเจือจางสองเท่าโดยเริ่มต้นที่ 1:5 ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ หนึ่งร้อยไมโครลิตร (100 ไมโครลิตร) ของการเจือจางซีรั่มและ 100 ไมโครลิตรของวัคซีน PPRV (วัคซีนสายพันธุ์ PPRV ไนจีเรีย 75/1) ที่ 1,000 TCID50/มล.ถูกผสมในจานเพาะเลี้ยงเซลล์ 96 หลุมและต่อมาบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°ซ ชุดของหลุมควบคุมสำหรับไวรัสและเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อได้รับการจัดเตรียมไว้ดังนี้: หกหลุมที่มี 100 TCID50(100 ไมโครลิตร) ต่อหลุม หกหลุมที่มี 10 TCID50(100 ไมโครลิตร) ต่อหลุม หกหลุมด้วย 1 TCID50(100 ไมโครลิตร) ต่อหลุม หกหลุมด้วย 0.1 TCID50(100 ไมโครลิตร) ต่อหลุม และหกหลุมที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อปลอดไวรัส 200 ไมโครลิตรต่อหลุม จานถูกบ่มเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่ 37°ซ ต่อจากนั้น สารแขวนลอยเวโรเซลล์ 50 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม และจานถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37°ซ ใน CO 5%2บรรยากาศ. เพลตได้รับการตรวจสอบเป็นระยะโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้าน และการอ่านค่าสุดท้ายเสร็จสิ้นหลังจากฟักไข่เป็นเวลา 2 สัปดาห์ การสังเกตผลไซโตพาทิก (CPE) บ่งชี้ว่า PPRV ไม่ได้ถูกทำให้เป็นกลางโดยการเจือจางในซีรั่ม เซรั่มถือเป็นผลบวกต่อแอนติบอดี PPRV หากการเจือจางที่ทำให้เป็นกลางมีค่ามากกว่าหรือเท่ากับ 1:10

เซลล์ Vero ซึ่งเก็บรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้ออินทรีดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM) ที่เสริมด้วย FCS 5% ยาปฏิชีวนะ (gentamicin 50 µg/ml) และสารต้านเชื้อรา (amphotericin B 2.5 µg/ml) เพาะเมล็ดหนึ่งวันก่อนการติดเชื้อใน 150 ซม.2ขวดเพาะเลี้ยงเซลล์ เมื่อเซลล์ชั้นเดียวรวมตัวกันถึง 70-80% พวกเขาติดเชื้อวัคซีน PPRV สายพันธุ์ไนจีเรีย 75/1 ที่อัตราการติดเชื้อหลายระดับ (MOI) 0.01 เก็บเซลล์ที่ติดเชื้อเมื่อระดับของ CPE อยู่ที่ประมาณ 80% อาหารเลี้ยงเชื้อถูกนำออกจากขวดแก้ว และโมโนเลเยอร์ของเซลล์ถูกล้างเบาๆ ด้วยน้ำเกลือ 0.01 โมลาร์บัฟเฟอร์ (PBS), pH 7.2 สารละลายบัฟเฟอร์ 10 มล. (รีเอเจนต์การสกัดโปรตีนจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม, เพียร์ซ) ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส (Halt Protease Inhibitor Cocktail: ปราศจาก EDTA, เพียร์ซ) ถูกเทลงบนเซลล์ จากนั้นขวดแก้วจะถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที แล้วละลายน้ำแข็ง (-80°C ถึง 37°C) สามครั้ง เซลล์ไลเซทที่เป็นผลลัพธ์ถูกรวบรวม หมุนเหวี่ยงที่ 500 กรัม เป็นเวลา 10 นาที และจากนั้นเก็บไว้ที่ -20°ซ

หนู BALB/c ได้รับการสร้างภูมิคุ้มกันโดยการฉีดเข้าช่องท้องด้วยอิมัลชัน 200 ไมโครลิตรของวัคซีน PPRV ที่ลดทอนแบบมีชีวิต (สายพันธุ์ไนจีเรีย 75/1) ผสม 1:1 ในอาหารเสริมที่สมบูรณ์ของ Freund ฉีดบูสเตอร์สามครั้งในช่วงเวลาสามสัปดาห์: สองครั้งแรกบูสต์ด้วยสารเสริมของ Freund ที่ไม่สมบูรณ์ และบูสต์สุดท้ายที่ไม่มีสารเสริมใดๆ สี่วันหลังจากการเร่งครั้งสุดท้าย เซลล์ม้ามถูกรวบรวมและหลอมรวมเข้ากับเซลล์ Ag8 myeloma (ได้รับจาก FAO/IAEA Laboratories ประเทศออสเตรีย) การเลือกและการโคลนเซลล์ไฮบริโดมาดำเนินการในขั้นตอนเดียว ตามโปรโตคอลของ ClonaCell™-HY Kit (StemCell Technologies, Canada) โคโลนีของเซลล์ไฮบริโดมาถูกรวบรวมหลังจาก 14 วันและเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม ทำการทดสอบทางอ้อม ELISA (iELISA) เพื่อคัดกรองโคลนที่ผลิต MAbs ในเชิงบวก โดยใช้แอนติเจนหยาบ PPRV และโปรตีน PPRV ชนิดรีคอมบิแนนท์: โปรตีน N [[35] ] และฟอสโฟโปรตีน (โปรตีน P) (ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่) ทั้งคู่แสดงออกในเซลล์แมลง (SF9) โดยสังเขป เพลต ELISA (Nunc-MaxiSorp) ถูกเคลือบด้วยสารละลายแอนติเจน (100 ไมโครลิตร/หลุม) และบ่มที่ 4°ซ ข้ามคืน จากนั้นจานถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์การล้าง: (0.002 M PBS ที่มี 0.05% Tween 20 [PBS-T] เพื่อกำจัดแอนติเจนที่ไม่ถูกจับ พื้นที่จับอิสระที่เหลืออยู่ในหลุมจานถูกปิดกั้นโดยใช้ 200 µl ของ PBS-T ที่มี 5 % นมพร่องมันเนย (PBS-T-Milk) บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37°C สารละลายปิดกั้นถูกเอาออก และ 100 µl ของอาหารเลี้ยงเซลล์จากเซลล์ไฮบริโดมาถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 30 นาที และล้างอีกครั้งตามข้างต้น จากนั้น คอนจูเกตที่มีฉลากต่อต้านหนูเมาส์อิมมูโนโกลบูลินเปอร์ออกซิเดส (ดาโก เดนมาร์ก) 100 µl เจือจาง 1:1000 ใน PBS-T-Milk ลงในแต่ละหลุม จานถูกบ่มเพิ่มเติมที่ 37°C สำหรับ 30 นาที เพลตถูกล้างอีกครั้งด้วย PBS-T, 100 µl ของสารตั้งต้นโครโมนิก 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม และเพลตถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 37°C การพัฒนาสีหยุดลงด้วยกรดซัลฟิวริก 1 โมลาร์ 100 ไมโครลิตร และอ่านความหนาแน่นเชิงแสง (OD) ของแต่ละหลุมโดยใช้เครื่องอ่านสเปกโทรโฟมิเตอร์พร้อมตัวกรองที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

MAbs ที่ยังไม่ทำปฏิกิริยากับโปรตีน recombinant N และ P ได้รับการทดสอบโดยการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันเพื่อระบุโปรตีนที่มีผลผูกพัน ส่วนลอยเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ไฮบริโดมาในอาหารที่ปราศจากซีรั่มถูกบ่มด้วยโปรตีน A agarose (Thermo Scientific Pierce) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง เม็ดบีดถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ และล้างสามครั้งด้วย PBS-T เพื่อกำจัด MAb ที่ไม่ถูกผูกไว้ แอนติเจนที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ PPRV ถูกเติมลงในเม็ดบีดและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น ลูกปัดถูกล้างสี่ครั้งด้วย PBS-T และวิเคราะห์โปรตีนที่ตกตะกอนด้วย SDS-PAGE การทำ isotyping ของ MAb ของเมาส์ (คลาสอิมมูโนโกลบูลิน, คลาสย่อยและสายเบา) ถูกดำเนินการโดยใช้ Rapid ELISA Mouse MAb Isotyping Kit (Thermo Scientific Pierce)

MAb ที่มุ่งต้านโปรตีน PPRV H (อธิบายไว้ข้างต้น) ถูกทำให้ตกตะกอนโดยใช้สารละลายแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว 50% ระหว่างการบ่มข้ามคืนที่ +4°ซ เม็ดอิมมูโนโกลบูลิน (Ig) ถูกรวบรวมหลังจากการปั่นแยก (10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที) และละลายในบัฟเฟอร์ PBS สำหรับการล้างไตโดยใช้ Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassette (Thermo Scientific) ที่มีขีดจำกัดการแยกเมมเบรนที่ 20 kDa ใช้บัฟเฟอร์ PBS เป็นบัฟเฟอร์ฟอกไต จากนั้น Ig ที่รวบรวมได้จะถูกควบรวมกับฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) ตามโปรโตคอล EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit (Pierce Cat. หมายเลข 31487) HRP-conjugated MAb (C4F3-HRP) ได้รับการทดสอบเพื่อประเมินการใช้เป็นแอนติบอดีของคู่แข่งในบริบทของการตั้งค่า ELISA แบบปิดกั้น แอนติเจนที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ PPRV ถูกไทเทรตโดยใช้ C4F3-HRP เป็นแอนติบอดีในการตรวจจับ เพลต ELISA (นูน-แม็กซิซอร์ป) ถูกเคลือบข้ามคืนที่อุณหภูมิห้องด้วยการเจือจางแอนติเจน 100 ไมโครลิตร โดยให้ OD ประมาณ 1.5 ด้วยตัวกรองที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร จากนั้น เพลตถูกล้างสามครั้งด้วย PBS-T และทำการปิดกั้นอีพิโทป C4F3-HRP การเจือจางแบบอนุกรมสองเท่าของซีรั่มที่ให้ผลลบ PPR หนึ่งรายการและซีรั่มที่ให้ผลบวกของ PPR หนึ่งรายการถูกเตรียมและใช้เพื่อปิดกั้นอีพิโทป C4F3-HRP หนึ่งร้อยไมโครลิตรของซีรัมที่เจือจางใน PBS-T-Milk แต่ละอันถูกเติมลงในหลุมและบ่มเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่ 37°ซ จานถูกล้างสามครั้ง และคอนจูเกต C4F3-HRP 100 ไมโครลิตรที่เจือจางใน PBS-T-Milk ถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกบ่มที่ 37°ซ เป็นเวลา 45 นาที จานถูกล้างอีกครั้ง และสารตั้งต้น TMB (Sigma, Germany) 100 µl ถูกเติมลงในหลุม เพลตถูกบ่มที่ 37°ซ สำหรับการพัฒนาสีในช่วงเวลา 15 นาที การพัฒนาสีหยุดลงด้วยกรดซัลฟิวริก 1 โมลาร์ 100 µl และอ่านค่า OD โดยใช้เครื่องอ่านสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบไมโครเพลทพร้อมตัวกรองที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

กระบวนการ PPR-bELISA ที่ใช้ H ถูกสร้างขึ้นหลังจากการประเมินปฏิกิริยาการปิดกั้น epitope ของ C4F3-HRP โดยซีรั่มเชิงลบและเชิงบวกที่อธิบายไว้ข้างต้น การเจือจางของตัวอย่างซีรั่มที่จะใช้ในการทดสอบเบลิซาถูกกำหนดขึ้นที่ 1:4 ตามปฏิกิริยาการปิดกั้นอีพิโทปที่ได้รับจากซีรั่มที่ให้ผลบวก PPR การทดสอบดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการปิดกั้นอีพิโทป บัฟเฟอร์ควบคุม (CB), การควบคุมเชิงบวก (PC) และการควบคุมเชิงลบ (NC) ถูกรวมอยู่ในการทดสอบ OD ในหลุมถูกแปลงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้ง (PI) โดยใช้สูตรด้านล่างที่มีค่ามัธยฐาน OD ของ NC (ODเอ็น.ซี) และมัธยฐาน OD ของ CB (ODซี.บี),PI(%)=100-ODSample-ODCBODNC-ODCB×100.

การเจือจางสูงสุดของซีรั่มที่ตรวจพบได้โดย PPR-bELISA ที่มีฐานเป็นฐาน H ถูกกำหนดโดยการทดสอบการเจือจางแบบอนุกรมสองเท่าโดยเริ่มต้นที่ 1:2 ของซีรั่มที่มี PPR เป็นบวกอย่างยิ่งสองรายการและซีรั่มที่มี PPR ลบสองรายการ คำนวณค่าเฉลี่ยของ PI ที่ซ้ำกันของการทดสอบการเจือจางซีรั่มแต่ละครั้ง

ห้าร้อยแปดสิบเจ็ด (587) ซีรั่มเชิงลบ PPR จากสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็ก (227 จากบอตสวานา 200 จากเยอรมนี และ 160 จากมาลาวี) ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดจุดตัดและความจำเพาะในการวินิจฉัยของ PPR-bELISA ที่ใช้ H หกร้อยเจ็ดสิบเอ็ด (671) ใช้ซีรั่มจากแพะและแกะที่ได้รับการฉีดวัคซีน (514 ตัวจากโซมาเลียและ 157 ตัวจากเอธิโอเปีย) เป็นตัวอย่างจากประชากรที่มี PPR บวกเพื่อกำหนดความไวของ PPR-bELISA ที่ใช้ H แผงซีรั่มยังได้รับการทดสอบโดยใช้การทดสอบทางการค้า ID Screen® PPR Competition

ความสามารถในการทำซ้ำของ PPR-bELISA ที่ใช้ H ได้รับการประเมินโดยการทดสอบซีรั่มที่ให้ผลบวกจากการทดลองสองครั้ง เซรั่มแต่ละชิ้นได้รับการทดสอบซ้ำ 26 ครั้งต่อแผ่นในการทดสอบสองครั้งและโดยช่างเทคนิคสามคน ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ของข้อมูล OD ที่สร้างขึ้นต่อการทดสอบสำหรับแต่ละตัวอย่างโดยช่างเทคนิคแต่ละคนถูกกำหนด ค่าเฉลี่ยของค่า SD ถูกคำนวณสำหรับช่างเทคนิคแต่ละคน และแปลงเป็นเปอร์เซ็นต์สัมประสิทธิ์ของการเปลี่ยนแปลง (%CV) ความสามารถในการทำซ้ำของ PPR-bELISA ที่ใช้ H ได้รับการประเมินตามเส้นทางการตรวจสอบความถูกต้องของการทดสอบ OIE (แผงเซรั่มอย่างน้อย 20 ตัวอย่างที่จะทดสอบในห้องปฏิบัติการอย่างน้อยสามแห่ง) ชุดคิท PPR-bELISA แบบ H และแผง 40 sera ถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการสี่แห่ง วิเคราะห์ข้อมูลจากแต่ละห้องปฏิบัติการเพื่อหาข้อตกลงของผลระหว่างห้องปฏิบัติการ

ซีรั่มทดลองแปดสิบรายการที่ผลิตที่ AU-PANVAC จากแพะและแกะถูกนำมาใช้เพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างการทดสอบ VNT, H-based PPR-bELISA และ ID Screen® PPR Competition

ใช้แพะสิบตัวเพื่อตรวจสอบจลนพลศาสตร์ของการผลิตแอนติบอดี PPR; เจ็ดตัวได้รับการฉีดวัคซีนด้วยวัคซีน PPR (PPRV สายพันธุ์ Nig75/1) และอีกสามตัวถูกใช้เป็นชุดควบคุมที่ไม่ได้รับวัคซีน เก็บ Sera ในวันที่ 0 และ 7, 14 และ 20 วันหลังการฉีดวัคซีน (dpv) สำหรับการทดสอบด้วยการทดสอบ PPR-bELISA แบบ H-based และ ID Screen® PPR Competition ELISA

สถิติคัปปาของโคเฮน (K) ได้รับการคำนวณและใช้เพื่อกำหนดข้อตกลงระหว่างผลการทดสอบ [[36] , [37] ]. ค่า K ถูกตีความดังนี้: ข้อตกลงที่ไม่ดี, K = 0; ข้อตกลงเล็กน้อย 0.01 < Κ < 0.20; ข้อตกลงที่เป็นธรรม 0.21< Κ < 0.40 ข้อตกลงปานกลาง 0.41 < Κ < 0.60; ข้อตกลงที่สำคัญ 0.61 < Κ < 0.80; ข้อตกลงที่ยอดเยี่ยม 0.81 < Κ < 1.00

ได้รับเซลล์ไฮบริโดมาหกโคโลนีที่แสดงการผลิต MAbs ที่เสถียรซึ่งทำปฏิกิริยากับแอนติเจน PPRV (รูปที่ 1) โมโนโคลนอลแอนติบอดี B4G12, MAb 2.15 และ MAb 1.2 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนดิบ PPRV และโปรตีน N; D6H2 และ A6D12 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจน PPRV และโปรตีน P และ C4F3 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจน PPRV เท่านั้น การแสดงลักษณะเพิ่มเติมโดยการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันแสดงให้เห็นว่า MAb C4F3 ทำปฏิกิริยากับโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 80 kDa ซึ่งสอดคล้องกับโปรตีน PPRV H (รูปที่ 2) การสร้างอิมมูโนโกลบูลินไอโซไทป์แสดงให้เห็นว่า MAbs ห้าชนิดเป็นประเภท IgG1 และอีกประเภทหนึ่งคือ IgA (ตารางที่ 1) MAb C4F3 ถูกผลิตขึ้นในสื่อที่ปราศจากซีรั่มและประเมินเพื่อพัฒนา ELISA สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีที่ต่อต้านโปรตีน PPRV H ปฏิกิริยาของ MAbs ที่สร้างขึ้นกับแอนติเจน PPRV ผลลัพธ์ ELISA ทางอ้อมของ MAbs ต้าน PPRV จับแอนติเจนดิบ PPRV และโปรตีน N และ P รีคอมบิแนนท์ PBS ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ PPR MAb สามกลุ่มถูกสร้างขึ้น: B4G12, MAb 2.15 และ MAb 1.2 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนและโปรตีน N ของ PPRV, D6H2 และ A6D12 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนและโปรตีน PPRV และ C4F3 ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนดิบของ PPRV เท่านั้น การระบุโปรตีนที่จับโดย MAb C4F3 โดยการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน โปรตีน PPRV ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันจากไลเซทโดย MAb 2.15 และ MAb C4F3 บนโปรตีน-A-อะกาโรสบีด คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันถูกแยกออกโดย SDS-PAGE Lane M: เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลโปรตีน (Invitrogen); เลน 1, โปรตีน-เอ-อะกาโรสบีด + MAb 2.15 + แอนติเจน PPRV; เลน 2, เม็ดโปรตีน -A-agarose + MAb 2.15 + เซลล์ Vero; เลน 3, เม็ดโปรตีน -A-agarose + MAb C4F3 + แอนติเจน PPRV; เลน 4, เม็ดโปรตีน -A-agarose + MAb C4F3 + เซลล์ Vero; เลน 5, เม็ดโปรตีน -A-agarose + เซลล์ Vero; เลน 6, โปรตีน-เอ-อะกาโรสบีด + แอนติเจน PPRV ผลลัพธ์แสดงว่า MAb 2.15 กระตุ้นโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุล 60 kDa (โปรตีน N); และ C4F3 ซึ่งเป็นโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุล 80 kDa (โปรตีน H) ลูกศรซ้ายที่เติม, สายหนักอิมมูโนโกลบูลิน (H); เปิดลูกศรซ้าย สายเบาของอิมมูโนโกลบูลิน (L); วงกลมเต็ม, N-PPRV (60 kDa); สามเหลี่ยมเปิด, H-PPRV, (80 kDa); สามเหลี่ยมเติม, สารเชิงซ้อน MAb C4F3 H+L ที่ไม่แปลงสภาพ

ผลการปิดกั้น epitope สำหรับซีรั่มแสดงในรูปที่ 3 ข้อมูลแสดงว่าการเจือจางในซีรั่มที่เป็นบวกของ PPR สามารถจับและปิดกั้นอีพิโทปของ MAb C4F3-HRP ที่เชื่อมเข้าด้วยกัน ขอบเขตของการปิดกั้นสูงมากสำหรับการเจือจาง 1:2 และ 1:8 โดยที่ความหนาแน่นของแสงใกล้ศูนย์ ขอบเขตของการปิดกั้นลดลงอย่างต่อเนื่องด้วยการเจือจางที่เพิ่มขึ้น ซีรั่มเชิงลบ PPR ไม่แสดงกิจกรรมการปิดกั้น epitope ใด ๆ จากผลลัพธ์เหล่านี้ C4F3-HRP ถูกนำมาใช้เพื่อพัฒนา bELISA.Epitope-blocking โดย sera การเจือจางแบบอนุกรมสองเท่าของซีรั่มเชิงลบและเชิงบวกของ PPR ถูกใช้เพื่อยับยั้งการจับของ MAb C4F3 ซีรั่มที่เป็นบวกสามารถปิดกั้นอีพิโทป MAb C4F3 ได้ถึงการเจือจาง 1:256 ในขณะที่การเจือจางของซีรั่มเชิงลบไม่แสดงการปิดกั้นใดๆ ของอีพิโทป

การแจกแจงแบบเกาส์เซียนของค่า PI ของ 587 PPR-negative และ 671 PPR-positive sera ที่ได้จากการทดสอบ PPR-bELISA แบบ H-based แสดงไว้ในรูปที่ 4 Sera จากกลุ่มประชากรที่มี PPR เชิงลบแสดงค่า PI ตั้งแต่ -24.66% ถึง 17.99% โดยมีค่ามัธยฐาน 2.66% และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ที่ 7.67 วิเคราะห์ค่าสองค่า 18% และ 25% ซึ่งสอดคล้องกับค่ามัธยฐานบวกสองเท่าของ SD (ค่ามัธยฐาน+2*SD) และค่ามัธยฐานบวกสามเท่าของค่า SD (ค่ามัธยฐาน+3*SD) ตามลำดับ เพื่อตีความผลการทดสอบ . ประชากรที่มี PPR บวกประกอบด้วยซีรั่มสามกลุ่ม: กลุ่มที่ 1 มี PI ตั้งแต่ -20% ถึง 17.5% ทับซ้อนกับประชากรเชิงลบ: กลุ่มที่ 2 มี PI จาก 20% ถึง 52.5%; และกลุ่มที่ 3 โดยมี PI สูงกว่า 52.5% การแจกแจงแบบเกาส์ของ PI จากการทดสอบที่ดำเนินการด้วย PPR-bELISA ที่ใช้ H แถบสีน้ำเงินแสดงถึงการกระจายตัวของ PI ของซีรั่มเชิงลบจากสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็ก (n = 587) และแถบสีแดงแสดงถึงการกระจายตัวของ PI ของซีรั่มที่เป็นบวก (n = 671) ค่า PI ของ PPR-negative sera อยู่ระหว่าง -24.66 ถึง 17.99% โดยมีค่ามัธยฐานอยู่ที่ 2.66% และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานที่ 7.67 มีซีรั่มสามกลุ่มในประชากรที่มี PPR บวก: กลุ่มที่ 1 ทับซ้อนกับประชากรเชิงลบ โดยมี PI ตั้งแต่ -20% ถึง 17.5% กลุ่มที่ 2 มีช่วง PI ที่ 20% ถึง 52.5% และกลุ่มที่ 3 มี PI มูลค่าสูงกว่า 52.5%

PPR-bELISA ที่ใช้ H นั้นได้รับการปรับให้เหมาะสมและใช้เพื่อทดสอบการเจือจางแบบอนุกรมสองเท่าของซีรั่มเชิงบวกสองรายการและซีรั่มเชิงลบสองรายการ การเจือจางสูงสุดสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน PPRV ในซีรั่มอย่างจำเพาะถูกกำหนดให้เป็น 1:64 สำหรับซีรั่มที่ให้ผลบวก 1 และ 1:34 สำหรับซีรั่มที่ให้ผลบวก 2 (รูปที่ 5) โดยใช้จุดตัด 18% หรือ 25% ซีรั่มเชิงลบไม่แสดงกิจกรรมการปิดกั้น epitope ความไวในการวิเคราะห์ของ PPR-bELISA ที่ใช้ H การทดสอบการเจือจางของซีรั่มเชิงบวก 2 เส้น (เส้นประ) และซีรั่มเชิงลบ 2 รายการ (เส้นทึบ) ด้วย PPR-bELISA ที่ใช้ H การเจือจางสูงสุดสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต้าน PPRV อย่างจำเพาะโดยใช้ค่าคัตออฟ 18% (เส้นจุดสีน้ำเงิน) และ 25% (เส้นจุดสีแดง) คือ 1:64 (ซีรั่มที่ให้ผลบวก 1) และ 1:34 (ซีรั่มที่ให้ผลบวก 2) . ไม่พบปฏิกิริยาการปิดกั้นสำหรับการเจือจางของซีรั่มเชิงลบทั้งสอง

ประสิทธิภาพการวินิจฉัยของการทดสอบแต่ละครั้งแสดงในตารางที่ 2 โดยใช้ค่าคัตออฟ 18% หรือ 25% สำหรับการแปลผลการทดสอบ ความจำเพาะในการวินิจฉัย (DSp) ของ H-based PPR-bELISA นั้นประมาณได้ 100% โดยใช้ 18% หรือ 25% เป็นค่าคัตออฟ สำหรับค่าความไวในการวินิจฉัย (DSe) พบ 94.18% และ 93.74% สำหรับค่าคัตออฟ 18% และ 25% ตามลำดับ การทดสอบที่ดำเนินการด้วยชุด ID Screen® PPR Competition บนแผงเดียวกันของซีรั่มระบุผลลัพธ์ต่อไปนี้: ความจำเพาะ 97.10% (โดยมีซีรั่มที่เป็นบวก 8 รายการจากประเทศที่ไม่มี PPR) และความไว 96.42%

ความสามารถในการทำซ้ำของการทดสอบ PPR-bELISA แบบ H ได้รับการทดสอบในห้องปฏิบัติการ AU-PANVAC โดยช่างเทคนิคสามคน และข้อมูลแสดงอยู่ในตารางที่ 3 ค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวน (CV) ของการทดสอบที่ดำเนินการโดยช่างเทคนิคแต่ละคนคือ 2.27%, 1.92% และ 2.22% CV เฉลี่ยคำนวณเป็น 2.14% ซึ่งแสดงถึงความสามารถในการทำซ้ำการทดสอบ PPR-bELISA ที่ใช้ H (ความสอดคล้องของผลลัพธ์แบบจานต่อจาน) เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำของการทดสอบ ได้ทำการเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัติการ ชุด PPR-bELISA แบบ H ถูกแจกจ่ายไปยังห้องปฏิบัติการสี่แห่ง และผลการทดสอบที่ดำเนินการบนแผงควบคุม 40 ซีรั่ม (ซีรั่มที่ให้ผลบวก PPR 21 ชุด และซีรั่มเชิงลบ 19 ชุด) แสดงข้อตกลง 100% (คัปปา = 1) กับผลลัพธ์ที่คาดหวัง

ซีรั่มทดลองแปดสิบรายการที่ทดสอบก่อนหน้านี้โดยใช้ VNT (ซีรั่มเชิงลบ 49 รายการและซีรั่มเชิงบวก 31 รายการ) ถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบกับการทดสอบ PPR-bELISA และ ID Screen® PPR Competition ที่ใช้ H พบซีรั่มเชิงลบ VNT ทั้งหมดโดยใช้ H-based PPR-bELISA (PI <18%) และ ID Screen® PPR Competition (PI < 40%) ในบรรดาซีรั่มที่เป็นบวกของ VNT พบว่ามีสองคนที่เป็นลบด้วยการทดสอบทั้งสอง ข้อตกลง Kappa ของการแข่งขัน PPR-bELISA และ ID Screen® PPR แบบ H กับ VNT ได้รับการคำนวณเป็น 0.947

การวิเคราะห์จลนพลศาสตร์ของการผลิตแอนติบอดีต้าน PPRV ในสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กที่ตรวจพบโดย ID Screen® PPR Competition และ PPR-bELISA ที่ใช้ H แสดงไว้ในรูปที่ 6 แผนภูมิฮิสโตแกรมแสดงค่า PI ที่ได้จากการทดสอบแต่ละครั้งสำหรับซีรั่มที่ 0, 7, 14 และ 21 dpv สำหรับสัตว์ที่ได้รับวัคซีนและไม่ได้รับวัคซีน ELISA ทั้งสองแสดงความสามารถในการตรวจหาแอนติบอดีต่อ PPRV ที่เริ่มต้นที่ 7 dpv ที่มีการแปรผันของรูปแบบจลนพลศาสตร์ของแอนติบอดีต้าน N และต้าน H แอนติบอดีต่อโปรตีน N ที่ตรวจพบโดย ID Screen® PPR Competition เกือบถึงระดับสูงสุดที่ 7 dpv (รูปที่ 6A) ในขณะที่แอนติบอดีต่อโปรตีน H ที่ตรวจพบโดย PPR-bELISA ที่ใช้ H นั้นยังคงเพิ่มขึ้นและถึงระดับสูงสุดที่ 14 dpv (รูปที่ 6B) สัตว์ควบคุมที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนทั้งหมดยังคงมีผลเป็นลบในการตรวจทั้งสอง จลนพลศาสตร์ของสัตว์ที่ได้รับวัคซีน PPR แบบ seroconversion ตรวจพบโดย ID Screen®PPR Competition (A) และ PPR-bELISA ฐาน H (B) ค่า PI ด้านบนหรือบนเส้นประสีแดง (50% สำหรับการแข่งขัน ID Screen® PPR และ 25% สำหรับ PPR-bELISA แบบ H-based) เป็นค่าบวก ค่า PI ต่ำกว่าหรือบนเส้นประสีน้ำเงิน (40% สำหรับการแข่งขัน ID Screen® PPR และ 18% สำหรับ PPR-bELISA แบบ H) มีค่าเป็นลบ และตัวอย่างที่สงสัยจะมีค่า PI ระหว่างเส้นประสีน้ำเงินและสีแดง (40% และ 50% สำหรับ ID Screen® PPR Competition และ 18% และ 25% สำหรับ H-based PPR-เบลิซา). แผนภูมิฮิสโทแกรมแสดงค่า PI ที่ได้จากการทดสอบแต่ละครั้งที่ 0, 7, 14 และ 21 dpv สำหรับสัตว์ที่ได้รับวัคซีนและไม่ได้รับวัคซีน ELISA ทั้งสองตรวจพบการแปลงซีโรเป็น PPRV ที่ 7 dpv การผลิตแอนติบอดีต่อต้านโปรตีน N จากสัตว์ที่ได้รับวัคซีนเกือบถึงระดับสูงสุดที่ 7 dpv (A) ในขณะที่การผลิตแอนติบอดีต่อต้านโปรตีน H ตรวจพบได้ที่ 7 dpv และเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องจนกระทั่งถึงระดับสูงสุดประมาณ 14 หรือ 21 dpv (B) สัตว์ที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนควบคุมทั้งหมดยังคงมีผลบวกต่อ PPRV

การทดสอบด้วยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนต์แอสเซย์ (ELISA) เป็นหนึ่งในการทดสอบอย่างง่ายทั่วไปที่ใช้สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยเพื่อวินิจฉัยโรคและติดตามประสิทธิภาพของโปรแกรมการฉีดวัคซีน สำหรับ PPR ตลาดจะจำกัดอยู่ที่ชุด ELISA เชิงพาณิชย์หนึ่งชุด ซึ่งปัจจุบันผลิตและจัดจำหน่ายโดย IDvet (ฝรั่งเศส) ห้องปฏิบัติการสัตวแพทย์ในแอฟริกาส่วนใหญ่เผชิญกับความท้าทายในการจัดหา ID Screen® PPR Competition ที่มีจำหน่ายในท้องตลาด เนื่องจากมีค่าใช้จ่ายค่อนข้างสูง เพื่อแก้ไขปัญหานี้และเพื่อให้มีชุดเครื่องมือ ELISA ที่ผลิตในประเทศในราคาย่อมเยาที่มีความไวและความจำเพาะสูง ชุด PPR-bELISA ที่ใช้ H จึงได้รับการพัฒนาและอธิบายไว้ในบทความนี้ BELISA ทำงานในลักษณะที่คล้ายคลึงกับ CELISA บนหลักการที่ว่าแอนติบอดีสองตัวสามารถแข่งขันกันเพื่อจับอีพิโทปเดียวกันได้ ในเบลิซา เซรั่มที่จะทดสอบจะถูกบ่มด้วยแอนติเจนก่อน ต่อมาแอนติบอดีที่แข่งขันกัน (โมโนโคลนอลแอนติบอดี) ทำปฏิกิริยากับอีพิโทปอิสระบนแอนติเจน สำหรับ cELISA นั้น ซีรั่มทดสอบและแอนติบอดีที่แข่งขันกันจะถูกสัมผัสพร้อมกันกับแอนติเจนในระหว่างการฟักตัว ผลลัพธ์สำหรับการทดสอบทั้งสองแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้ง ซึ่งสะท้อนถึงความสามารถของซีรั่มทดสอบในการลดการจับกันของแอนติบอดีที่แข่งขันกัน ขั้นตอนของเบลิซาได้รับการอธิบายว่าดำเนินการได้ง่าย ละเอียดอ่อน เฉพาะเจาะจง ทำซ้ำได้ และทำซ้ำได้ [[38] - [40] ]. PPR-bELISA บนพื้นฐานของ H ที่พัฒนาขึ้นใหม่ใช้เป็นแอนติบอดีที่แข่งขันกันคือโมโนโคลนอลแอนติบอดี (MAb C4F3) ที่จดจำอีพิโทปที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นบนโปรตีน H MAb C4F3 ทำปฏิกิริยากับโปรตีน PPRV ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 80 kDa ซึ่งสอดคล้องกับรูปแบบ glycosylated ที่โตเต็มที่ของโปรตีน morbillivirus H [[41] - [44] ]. พบรูปแบบที่คล้ายกันของโปรตีน H ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 77 kDa และ 80 kDa ในเซลล์ที่ติดเชื้อ RPV [[45] ] นอกเหนือจากรูปแบบไกลโคซิเลตที่มีน้ำหนักโมเลกุล 74 กิโลดาลตัน [[46] ]. ฤทธิ์ทางชีวภาพของ MAb C4F3 ได้รับการประเมิน และแสดงความสามารถในการต่อต้าน PPRV ใน VNT (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับ MAbs ต่อต้านโปรตีน H อื่น ๆ จากไวรัส morbilliviruses [[47] - [49] ]. แท้จริงแล้ว โปรตีน H เป็นที่ทราบกันดีว่าสร้างแอนติบอดีที่เป็นกลางและป้องกันส่วนใหญ่ในระหว่างการติดเชื้อหรือการฉีดวัคซีนด้วย morbillivirus [[50] - [53] ]. MAb C4F3 ที่ติดฉลากด้วยฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดส (C4F3-HRP) ถูกใช้เป็นคอนจูเกตเพื่อพัฒนาเบลิซาสำหรับการตรวจจับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่มุ่งต้าน PPRV ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับปฏิกิริยาการปิดกั้นอีพิโทปแสดงให้เห็นว่าการเจือจางของซีรั่มต้าน PPRV ที่เป็นบวกสามารถจับและปิดกั้นอีพิโทปที่จดจำโดย MAb C4F3 เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งพบว่าเกือบ 100% ด้วยการเจือจาง 1:2 ถึง 1:8 PPR-bELISA ที่มีฐานเป็น H ได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยใช้การเจือจางตัวอย่างซีรั่มที่ 1:4 เพื่อให้แน่ใจว่าแยกความแตกต่างได้ง่ายระหว่างซีรั่มที่เป็นบวกและลบ การตรวจสอบความถูกต้องของการทดสอบได้ดำเนินการตาม OIE "หลักการและวิธีการตรวจสอบความถูกต้องของการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อ" [[54] ]. ซีรั่มสองแผง 587 ซีรั่มเชิงลบ PPR จากประเทศที่ไม่มีกรณีใด ๆ ของ PPR และ 671 ซีรั่มจากประชากรที่มี PPR บวกได้รับการทดสอบด้วย PPR-bELISA แบบ H ค่ามัธยฐานของค่า PI จาก PPR-negative sera บวก 2*SD (18%) หรือ 3*SD (25%) ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ PPR-bELISA แบบอิง H เมื่อใช้ค่าคัตออฟ 18% DSp และ DSe ถูกสร้างขึ้นที่ 100% และ 94.18% ตามลำดับ สำหรับค่าคัตออฟ 25% DSp ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงที่ 100% แต่ DSe ลดลงเล็กน้อยเป็น 93.74% จากนั้นจึงกำหนดเกณฑ์ต่อไปนี้และใช้เพื่อตีความผลการทดสอบ PPR-bELISA แบบ H: ค่า PI ที่ต่ำกว่าหรือเท่ากับ 18% (PI ≤ 18%) ถือเป็นค่าลบ ค่า PI ที่มากกว่าหรือเท่ากับ 25% ( PI ≥25%) ถือว่าเป็นค่าบวก และตัวอย่างที่เป็นหนี้สงสัยจะสูญมีค่า PI มากกว่า 18% และต่ำกว่า 25% นอกจากนี้ แผงของ PPR-negative และซีรั่มที่เป็นบวกยังได้รับการทดสอบด้วย ID Screen® PPR Competition ซึ่งแสดงความจำเพาะ 97.10% และความไว 96.42% การเจือจางตัวอย่างซีรั่มทดสอบที่ 1:4 ที่ใช้ในการตรวจหา PPR-bELISA แบบ H-based ได้รับการตรวจสอบแล้ว เนื่องจากข้อมูลความไวในการวิเคราะห์ (รูปที่ 5) แสดงให้เห็นว่าการเจือจางสูงสุดสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน PPRV อย่างจำเพาะคือ 1:64 (ผลบวก ซีรั่ม 1) และ 1:34 (ซีรั่มที่เป็นบวก 2) โดยไม่คำนึงว่าค่าคัตออฟคือ 18% หรือ 25% ผลลัพธ์ของการตรวจสอบการทดสอบบ่งชี้ว่า PPR-bELISA ที่ใช้ H นั้นมีความเฉพาะเจาะจงมากกว่าการแข่งขัน ID Screen® PPR สิ่งนี้อาจอธิบายได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าโปรตีน H ได้รับการอนุรักษ์น้อยกว่าในหมู่ไวรัสมอร์บิลลิ [[52] ] และอาจกระตุ้นแอนติบอดีที่จำเพาะมากขึ้น อีพิโทปของ MAb C4F3 สามารถถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในบริเวณเฉพาะของโปรตีน H ในทางตรงกันข้าม โปรตีน N ได้รับการอธิบายว่ามีการอนุรักษ์ไว้ค่อนข้างดีในหมู่ไวรัสมอร์บิลลิ [[52] , [55] ]. ระดับของลำดับเอกลักษณ์ของไวรัสต่างๆ ขึ้นอยู่กับบริเวณโปรตีน N ที่ตรวจสอบ: 75.2% ถึง 82.8% สำหรับกรดอะมิโน 1 ถึง 122 และ 86% ถึง 90.5% สำหรับกรดอะมิโน 145 ถึง 420 [[55] ]. บริเวณที่มีความคล้ายคลึงกันของลำดับระดับสูงจะสร้างแอนติบอดีที่ทำปฏิกิริยาข้ามระหว่าง morbilliviruses ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้สำหรับ RP-positive sera [[56] ]. ซีรั่มจากประเทศที่ไม่มี PPR ซึ่งพบว่าผลบวกกับ ID Screen® PPR Competition อาจเป็นผลบวกเนื่องจากปฏิกิริยาข้ามกับแอนติบอดีที่สร้างขึ้นในสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กโดยไวรัส morbilli เช่น CDV ในความเป็นจริง สัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กในฟาร์มมักจะสัมผัสกับสุนัขและอาจแบ่งปันการติดเชื้อ CDV และเกิดซีโรคอนเวอร์ชั่นได้ สมมติฐานนี้จำเป็นต้องได้รับการยืนยันโดย VNT สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้านซีดีวีอย่างจำเพาะ การเปรียบเทียบการวิเคราะห์โดยใช้ field sera จากประชากรสัตว์ที่ได้รับการฉีดวัคซีนแสดงให้เห็นว่า PPR-bELISA ที่มีฐาน H มีความไวน้อยกว่าการแข่งขัน ID Screen® PPR เล็กน้อย โปรตีน N เป็นโปรตีนหลักของไวรัสที่สังเคราะห์ขึ้นระหว่างการจำลองแบบของไวรัสมอร์บิลลิ [[52] ] กระตุ้นให้เกิดระดับแอนติบอดีต่อต้านโปรตีน N ที่มีนัยสำคัญในช่วงแรกของการติดเชื้อ PPRV [[56] , [57] ]. แอนติบอดีเหล่านี้ตรวจจับได้ง่าย ดังที่แสดงโดยจลนพลศาสตร์ของการผลิตแอนติบอดีต่อต้าน PPRV (รูปที่ 6A) และอาจอธิบายความแตกต่างเล็กน้อยในความไวที่สังเกตได้จาก PPR-bELISA ที่ใช้ H อย่างไรก็ตาม แอนติบอดีต่อต้าน H ยังผลิตในระดับที่ใกล้เคียงกับแอนติบอดีต่อต้าน N และ PPR-bELISA ที่มีฐานเป็น H สามารถตรวจพบแอนติบอดีเหล่านั้นโดยเริ่มต้นที่ 7 dpv (รูปที่ 6B) โดยให้ผลลัพธ์คล้ายกับแอนติบอดีเหล่านั้น ได้รับจากการแข่งขัน ID Screen® PPR เวลาที่เหมาะสมสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน H โดย PPR-bELISA ที่ใช้ H คือ 21 วันหลังการติดเชื้อ (หรือหลังการฉีดวัคซีน) แอนติบอดีที่ต่อต้านโปรตีน H หรือโปรตีน N อยู่ในระดับสูงที่ 21 dpv และ ELISA ทั้งสองแสดงความสัมพันธ์ที่คล้ายคลึงกันกับ VNT การแข่งขัน PPR-bELISA และ ID Screen® PPR แบบ H แสดงความสัมพันธ์ที่คล้ายคลึงกันกับ VNT โดยมีข้อตกลงคัปปาที่ 0.947 ซึ่งบ่งชี้ข้อตกลงที่เกือบจะสมบูรณ์แบบ [[37] ]. ความสามารถในการทำซ้ำของ PPR-bELISA แบบ H ถูกกำหนดโดยการประมาณค่า CV ของการทดสอบที่ดำเนินการภายในบริษัท (ห้องปฏิบัติการ AU-PANVAC) โดยช่างเทคนิคสามคน ข้อมูลสำหรับช่างเทคนิคแต่ละคนแสดงค่า CV ดังต่อไปนี้ 2.27%, 1.92% และ 2.22% ค่าเฉลี่ยของค่า CV คือ 2.14% ซึ่งบ่งชี้ความสามารถในการทำซ้ำที่ดีของ PPR-bELISA ที่ใช้ H การทดสอบ PPR-bELISA ที่ใช้ H แสดงให้เห็นข้อตกลง 100% ในผลลัพธ์จากห้องปฏิบัติการทั้งหมด การศึกษาความสามารถในการทำซ้ำได้แสดงให้เห็นถึงความทนทานของชุด PPR-bELISA แบบ H ที่ผลิตขึ้น เนื่องจากข้อมูลการควบคุมของการทดสอบจากห้องปฏิบัติการทั้งหมดอยู่ในขอบเขตที่ยอมรับได้ (ข้อมูลไม่แสดง) กระบวนการตรวจสอบพบว่า H-based PPR-bELISA มีความไวสูงและเฉพาะเจาะจง สามารถทำซ้ำและทำซ้ำได้ ทำให้การทดสอบใหม่นี้เป็นเครื่องมือที่ดีสำหรับการเฝ้าระวังและติดตามโครงการรณรงค์ให้วัคซีนต่อต้าน PPR เมื่อพิจารณาจำนวนทางทฤษฎีของตัวอย่างที่เป็นบวกและลบซึ่งจำเป็นสำหรับเส้นทางการตรวจสอบความถูกต้องของ OIE assay และแผงของ sera (บวกและลบ) ที่ใช้สำหรับการประเมินประสิทธิภาพการวินิจฉัย PPR-bELISA แบบ H-based จึงเป็นไปได้ที่จะสรุปได้ว่า DSp และ DSe มี ได้รับการประเมินที่ความเชื่อมั่น 99% โดยมีส่วนต่างของข้อผิดพลาด 2%

โดยสรุป การตรวจสอบแสดงให้เห็นว่าการทดสอบ H-based PPR-bELISA มีความไวสูง จำเพาะ ทำซ้ำได้ และทำซ้ำได้สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน PPRV อีพิโทปที่จดจำโดย MAb C4F3 ดูเหมือนจะเป็นตำแหน่งแอนติเจนที่สำคัญบนโปรตีน H สำหรับการสร้างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันวิทยาที่ดีในสัตว์ ข้อมูลแสดงให้เห็นว่า H-based PPR-bELISA ยังแสดงผลการวินิจฉัยที่ดี (ความจำเพาะและความไว) สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน PPRV หลังการฉีดวัคซีน ซึ่งคล้ายกับชุด ID Screen® PPR Competition เชิงพาณิชย์ การเปรียบเทียบการทดสอบแสดงให้เห็นข้อตกลงที่เกือบจะสมบูรณ์แบบของผลลัพธ์ PPR-bELISA แบบ H กับ VNT ซึ่งทำให้การทดสอบนี้เป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมในการระบุสถานะทางเซรุ่มวิทยาของ PPR ของสัตว์แต่ละตัวหรือฝูงสำหรับการเฝ้าระวังและควบคุม PPR

การศึกษาวิจัย PPR-bELISA แบบ H ได้รับทุนสนับสนุนภายใต้งบประมาณของคณะกรรมาธิการสหภาพแอฟริกา

เราขอขอบคุณบุคคลและสถาบันต่างๆ ต่อไปนี้สำหรับการจัดหาซีรั่มของสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กสำหรับกระบวนการตรวจสอบผลการทดสอบ: ดร. จอร์จ มาทโล (สถาบันวัคซีนบอตสวานา: gmatlho@bvi.co.bw) สำหรับซีรั่มเชิงลบ PPR จากบอตสวานา ดร. เบิร์นด์ Hoffmann (Friedrich-Loeffler-Institut: Bernd.Hoffmann@fli.bund.de) สำหรับ PPR-negative sera จากเยอรมนี และ Dr. Tesfaye Rufael (ศูนย์วินิจฉัยและสอบสวนสุขภาพสัตว์แห่งชาติของเอธิโอเปีย (NAHDIC): rufaelc@yahoo com) สำหรับการจัดหาซีรั่มจากสัตว์ที่ได้รับการฉีดวัคซีนจากประเทศเอธิโอเปีย PPR post-vaccination sera จากโซมาเลียและ PPR-negative sera จากมาลาวีได้รับภายใต้โครงการ OSRO/SOM/301/MUL (สนับสนุนทางการเงินโดยองค์การอาหารและเกษตรแห่งสหประชาชาติ - FAO) และวัคซีนเพื่อการควบคุมโรคสัตว์ที่ถูกทอดทิ้ง ในแอฟริกา-VACNADA (สนับสนุนโดยสหภาพยุโรป-สหภาพยุโรป) ตามลำดับ

BSC ออกแบบและควบคุมการศึกษา สร้างโมโนโคลนอลแอนติบอดีและผลิตรีเอเจนต์ที่ใช้ในการพัฒนาการทดสอบ ดำเนินการทดสอบ ELISA บางส่วนและเตรียมต้นฉบับ BJD ดำเนินการทดสอบ ELISA และจำแนกโมโนโคลนอลแอนติบอดี NN มีส่วนร่วมในการวิเคราะห์ข้อมูลการทดสอบและตรวจสอบต้นฉบับ เคทีมีส่วนในการออกแบบการศึกษาและวิเคราะห์ข้อมูล KYM ดำเนินการทดสอบ ELISA สำหรับการเปรียบเทียบการทดสอบ CHE เข้าร่วมในการศึกษาทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ DM เข้าร่วมในการศึกษาการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ GD เข้าร่วมในการศึกษาการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ TIBA เข้าร่วมในการศึกษาทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ ML เข้าร่วมการศึกษาทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ AD มีส่วนในการวิเคราะห์ผลการศึกษา ผู้เขียนทั้งหมดอ่านและได้รับการอนุมัติขั้นสุดท้ายที่เขียนด้วยลายมือ.

ผู้เขียนประกาศว่าพวกเขาไม่มีผลประโยชน์ทับซ้อน

ปฏิบัติตามแนวทางสากล ระดับชาติ และสถาบันที่เกี่ยวข้องทั้งหมดสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ AU-PANVAC เป็นหน่วยงานด้านเทคนิคเฉพาะของคณะกรรมาธิการสหภาพแอฟริกา ซึ่งได้ลงนามในข้อตกลงสำนักงานใหญ่กับรัฐบาลแห่งสหพันธ์สาธารณรัฐประชาธิปไตยเอธิโอเปีย กิจกรรมในห้องปฏิบัติการทั้งหมดดำเนินการตามกฎหมายและข้อบังคับของประเทศเอธิโอเปีย การจัดการกับสัตว์ดำเนินการภายใต้ระบบการจัดการคุณภาพ AU-PANVAC

1 Kitching RP, Thompson FS, ความสำคัญทางเศรษฐกิจและการควบคุมไวรัสสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กในแอฟริกาเหนือและเอเชียตะวันตก, การเพิ่มผลผลิตสัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็กในพื้นที่กึ่งแห้งแล้ง, 1988, Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 225, 236

AU-IBAR

สำนักทรัพยากรสัตว์แห่งสหภาพแอฟริการะหว่างแอฟริกา

AU-PANVAC

ศูนย์วัคซีนสัตวแพทย์แอฟริกันยูเนี่ยนแพนแอฟริกัน

เอลิซ่า

การปิดกั้นการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์

เซลิซ่า

การทดสอบภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ที่แข่งขันได้

ดีพีวี

วันหลังฉีดวัคซีน

เอลิซ่า

เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน

องค์การอาหารและยา

องค์การอาหารและเกษตรแห่งสหประชาชาติ

เกรป

โครงการกำจัด Rinderpest ทั่วโลก

สศอ

องค์การเพื่อสุขภาพสัตว์โลก

พี.พี.อาร์

สัตว์เคี้ยวเอื้อง Peste des petits

พีพีอาร์วี

Peste des petits ไวรัสสัตว์เคี้ยวเอื้อง

วี.เอ็น.ที

การทดสอบการวางตัวเป็นกลางของไวรัส

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)

ภาพถ่าย (สี)